La chiesa di S. Stefano protomartire, situata entro la cinta muraria di età sillana (80 a.C.), posta nella parte alta del nucleo medioevale, ricadente nella contrada S. Paolo, sorge probabilmente su un'aula romana adibita a chiesa a partire dal V secolo d.C., allorquando Simplicio, papa tiburtino, donò nuovi templi alla sua terra natale, tra cui questo, per dedicarlo al santo, il cui culto, all'epoca, ebbe una notevole fioritura. La costruzione ha per fondamento, infatti, uno dei muri "ciclopici" o "serviani" che furono utilizzati per la sostruzione della terrazza del clivio tiburtino. L'impianto originario, dei secoli XI e XII, era costituito dalla navata centrale, da un portico antistante l'ingresso principale e dal campanile. Vi era inoltre, a destra entrando, una porta secondaria comunicante con un portichetto e poi un'altra porta che immetteva in un'area trasformata in cimitero e orto. In un angolo dietro l'abside, nel verso dell'attuale piazza del Comune, vi era una mensa lapidea dove il giudice sediale amministrava la giustizia. La Chiesa nel XVI secolo venne ampliata nella parte destra con la Cappella dei S. Stefano, oggi non più comunicante con la navata centrale, dedicata alla Natività, e nella parte sinistra sul fondo con la cappella dell'Annunziata, oggi scomparsa. Nel secolo XVI la cappella di S. Stefano venne trasformata in sagrestia, così come viene confermato nel 1595 della visita pastorale del vescovo Giovanni Andrea Croce. Per volere di Paolo V la chiesa fece parte della Congregazione dei Somaschi, che tuttavia dopo alcuni anni rinunciò per ragioni economiche ad utilizzare l'edificio per la loro attività didattica. Quindi Urbano VIII soppresse la parrocchia e ne devolvette i beni al Seminario tiburtino (1637). Poco dopo la soppressione della parrocchia, la chiesa fu assegnata ai frati Ospitalieri di S. Antonio di Vienna prima in custodia e poi ceduta in possesso, quando la chiesa di S. Antonio, presso la Porta del Colle, divenne pericolante. I frati imposero alla chiesa il nome del loro patrono. Furono ospitate anche due corporazioni; quella dei "carrettieri" e quella dei "somarari". Sebbene i frati avessero abbellito l'altare con marmi e costruita una cantoria nella chiesa, il complesso cadde sempre più in rovina. Nel 1782 vi fu interdetto il culto con l'intenzione di porre rimedio ai danni derivanti dall'incuria. In quegli stessi anni Pio VI soppresse l'ordine degli ospitalieri di S. Antonio di Vienna e la chiesa, insieme ad altri beni fu venduta all'Accademia dei Nobili ecclesiastici e trasformata, nel 1840, in teatro, poi a granaio, poi a laboratorio artigiano. Da quando non fu più luogo di culto l'intero complesso immobiliare subì trasformazioni edilizie, tra cui quella relativa all'adattamento in abitazione civile della parte soprastante l'ingresso principale inglobando il campanile romanico. Gli ultimi eventi bellici hanno completato la trasformazione della chiesa, che vedeva così distrutta la copertura lignea del tetto.